Influencia de las nanopartículas de Ag sobre las propiedades mecánicas y tribológicas y en el efecto citotóxico y bactericida de los recubrimientos de TaN(Ag)

Aida M. Echavarría^a,*, Sara Robledo^b, Gilberto Bejarano G.^a

^aCentro de Investigación, Innovación y Desarrollo de Materiales – CIDEMAT, Facultad de Ingeniería, Universidad de Antioquia - UdeA, Calle 70 Nº 52-21, Medellín, Colombia

^bPrograma de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales – PECET, IMM-Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia - UdeA, Carrera 53 Nº 61-30 SIU Laboratorio 632 Medellín, Colombia

*Autor para la correspondencia: aida.echavarria@udea.edu.co

1. INTRODUCCIÓNTOP

La modificación superficial a partir del dopaje de recubrimientos de nitruros metálicos nanocristalinos como el TaN, ZrN, TiN, MoN, CrN y NbN, caracterizados por su alta estabilidad química y excelentes propiedades mecánicas, con nanopartículas de metales dúctiles como la Ag, (Manninen et al., 2011), surgen como alternativa para aplicaciones donde se requiere mejorar la resistencia al desgaste y el desempeño de algunos aceros inoxidables, titanio y aleaciones de titanio, entre otros. A la buena biocompatibilidad de los nitruros mencionados y su elevada dureza se suma el efecto auto-lubricante y bactericida de las nanopartículas, potenciando aún más sus aplicaciones (Muratore et al., 2007; Echeverrigaray et al., 2016; Falconer y Grainger, 2017). Las propiedades mecánicas y el efecto bactericida del material compuesto mejoran ostensiblemente, siempre y cuando el tamaño de las partículas embebidas en la matriz sea inferior a 100 nm (Misra et al., 2012; Madhuree et al., 2016).

Los iones metálicos como Ag⁺, el Cu²⁺ y el Ni²⁺ han mostrado un efecto positivo para el control de la adherencia y la proliferación de diferentes tipos de bacterias; esta facultad actualmente viene aprovechándose para evitar la colonización de las mismas en componentes poliméricos y metálicos utilizados en el hogar, en la industria textil, en centros hospitalarios (Gopinath y Velusamy, 2013), así como también en el diseño de dispositivos de liberación controlada de fármacos de última generación y la fabricación de implantes (Chang et al., 2012; Taoyu et al., 2015; Wang et al., 2016;). Un ejemplo de ello es el estudio de la implantación de iones de plata en aceros inoxidables y matrices cerámicas, para la reducción de la adherencia bacteriana y posterior formación de biofilm de cepas como E. coli y S. aureos en dispositivos biomédicos y de P. aeruginosa en instrumentación quirúrgica (Echeverrigaray et al., 2016; Tallósy et al., 2016).

Para garantizar un elevado efecto bactericida y una apropiada biocompatibilidad en el material compuesto, debe mantenerse el equilibrio entre la cantidad, distribución y forma de nanopartículas de Ag presentes en la matriz del recubrimiento y la liberación de iones de Ag⁺ al medio circundante, de tal forma que se induzca a la muerte de las bacterias o se inhiba su adherencia, sin afectar la viabilidad celular, es decir, sin ser citotóxico (Tianlu et al., 2014). El mecanismo más discutido por medio del cual la plata ejerce su efecto bactericida, consiste en el enlace que forman los iones de Ag⁺ con moléculas biológicas o grupos funcionales de las paredes celulares de las bacterias, las cuales contienen oxígeno, azufre y nitrógeno que se caracterizan por ser donantes fuertes de electrones (Wei and Chu, 2008); una vez allí, los iones Ag⁺ tienen la capacidad de desplazar otros elementos como el Ca y el Zn que son necesarios para la supervivencia de los microorganismos, ocasionando por ende la muerte de la bacteria. Por ello se hace necesario que la cantidad de plata sea la requerida para contrarrestar la acción bacteriana sin afectar la viabilidad celular (Chang et al., 2012; Tianlu et al., 2014).

Acorde a lo anterior, este trabajo tiene como objetivo, evaluar inicialmente la influencia del contenido de Ag de los recubrimientos nanocompuestos de TaN(Ag) sobre la microestructura y sobre las propiedades mecánicas y tribológicas, una vez realizado esto se seleccionó el sistema de recubrimiento con el mejor balance microdureza/tasa de desgaste y se sometió a un ciclo de tratamientos térmicos en un rango de temperaturas entre 175 y 275 °C durante 4 min; allí se evaluó el tamaño, forma y distribución de las nanopartículas de Ag que emergieron a la superficie del compuesto. A la muestra tratada térmicamente que presentó la mejor distribución y el menor tamaño de partículas de plata, se le evaluó el efecto bactericida frente a la bacteria P. aeruginosa, y el carácter citotóxico frente a osteoblastos humanos.

2. MATERIALES Y MÉTODOSTOP

2.1. Deposición de recubrimientos y tratamiento térmicoTOP

Los recubrimientos se depositaron sobre muestras de acero inoxidable AISI 316L y obleas de Silicio unidireccional (100) mediante la técnica de pulverización catódica asistida por campo magnético desbalanceado, previamente desengrasadas en un baño de ultrasonido en una solución de acetona y propanol. Una vez en la cámara de pulverización, las muestras se sometieron a una limpieza iónica con argón durante 30 min. Previo a la deposición del sistema de recubrimientos TaN(Ag), los sustratos de acero fueron endurecidos superficialmente mediante un proceso de nitruración por plasma pulsado, utilizando una atmosfera de argón/nitrógeno/hidrógeno, a una presión de 6,3x10^-1 mbar, un voltaje bias de -750 V y a una temperatura de 380 °C durante 9 h. Posteriormente y con el fin de reducir la tensiones residuales en la interfase del acero inoxidable AISI 316L y el recubrimiento por la diferencia de dureza (Liskiewicz et al., 2005), se depositó una monocapa de anclaje de tantalio de aproximadamente 70 nm; una vez formada la capa de anclaje se procedió con el ingreso de nitrógeno para contribuir a la formación del nitruro de tantalio. Los recubrimientos de TaN(Ag) se realizaron según las condiciones descritas en la Tabla 1, en la cual se incluyen los espesores alcanzados para cada uno. Los substratos fueron posicionados a una distancia de 80 mm con respecto a dos blancos independientes de Ta y Ag con el 99,9% de pureza, girando a una velocidad de 30 rpm. Por último se realizó la pulverización del blanco de Ta con una potencia de 1500 W y del blanco de Ag con potencias entre 30 y 210 W durante 4 h para formar el compuesto TaN(Ag) con los diferentes contenidos de plata.

Los recubrimientos fueron tratados térmicamente en un horno tipo mufla con atmósfera controlada de nitrógeno. Estos ciclos incluyeron temperaturas de 175°, 200°, 225°, 250° y 275 °C, cada una de ellas durante 4 min, con enfriamiento inmediato mediante aire frio a presión. Este procedimiento permitió la difusión controlada de las nanopartículas de plata hasta la superficie, y de paso determinar la mejor relación de tamaño, forma y distribución de las nanopartículas de Ag sobre la superficie del recubrimiento, utilizando imágenes SEM de la superficie de las muestras y apoyados con el software ImageJ, como se discute más adelante en el apartado 3.2.1. En la Fig. 1a, se esquematiza la conformación del sistema multicapas del recubrimiento de TaN(Ag) depositado, así como el proceso de difusión de las nanopartículas de Ag, que toman forma de nano-wires y emergen hacia la superficie del recubrimiento a través de los límites de grano de la matriz de TaN, una vez realizado el tratamiento térmico (Fig. 1b).

2.2. Caracterización de los recubrimientosTOP

2.2.1. Evaluación de la morfología superficial, rugosidad, mojabilidad y análisis microestructural.TOP

La topografía superficial y la morfología transversal de los diferentes recubrimientos de TaN(Ag) se examinaron en un microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6490LV. La composición química de cada recubrimiento se determinó a partir de espectroscopia de energía dispersiva de rayos X (EDX) mediante el software INCA Energy. La formación de fases se caracterizó por difracción de rayos X en un equipo Panalytical Empyrean, en el modo de ángulo rasante, usando un ángulo de incidencia de 4° y paso de 0,02°/seg. La rugosidad de los recubrimientos se determinó por medio de un perfilómetro marca Bruker Pektakxt, con una fuerza de contacto de 3 mg, durante 30 s en un recorrido de 1500 micras, realizando 5 mediciones por muestra. Para determinar el grado de mojabilidad de los recubrimientos se determinó el ángulo de contacto por medio del equipo Rame-Hart contact angle & tensiometer model 250. Para estimar la distribución y densidad de nanopartículas se realizó el análisis de frecuencia, la cual representa el número de partículas promedio con un rango de diámetro en un área superficial determinada utilizando el software ImageJ.

2.2.2. Microdureza y comportamiento tribológicoTOP

La dureza de los recubrimientos se determinó mediante el método de Knoop con un microdurómetro Shimadzu modelo HMV-G20, utilizando una carga de 0,245 N acorde a la norma ASTM C1326-13. El coeficiente de fricción y la tasa de desgaste se evaluaron mediante un tribómetro tipo ”ball on disc”, usando un contra cuerpo de alúmina de 6 mm de diámetro, carga de 1 N, radio de la huella de 8 mm, tiempo de 600 s y 70 rpm, acorde a la norma ASTM G99-95. Todas las mediciones se realizaron por triplicado y se llevaron a cabo a temperatura de 19 ±2 °C y a una humedad relativa de 48,5 ±2%. Las muestras fueron lavadas previamente con etanol en un baño de ultrasonido y secadas con aire a presión. El volumen de desgaste fue determinado con un perfilómetro de contacto marca Bruker Pektakxt.

2.3. Ensayos biológicosTOP

2.3.1. Efecto bactericidaTOP

Para la evaluación in vitro del efecto bactericida, se utilizaron muestras de silicio con el recubrimiento de TaN(Ag), con áreas 2 cm² y como controles se utilizaron una muestra de silicio sin recubrir y un fragmento de vidrio, las cuales fueron previamente esterilizadas en autoclave a 120 °C durante 21 min. Se utilizaron muestras de silicio para esta evaluación, ya que las muestras de acero 316L presentaron un área superficial muy grande de 5 cm², que requerían de una gran cantidad de pozos y encarecían demasiado el costo del ensayo. Los ensayos de actividad antibacterial fueron llevados a cabo siguiendo la guía “OECD Quantitative Method for evaluating bactericidal efficacy of biocides use on hard surfaces (draft) y Jappanese Industrial Standard Antimicrobial products – test for antimicrobial activity and efficacy, JIS Z 208.2000”. Las muestras fueron expuestas a la bacteria P. aeruginosa (cepa ATCC^®27853TM) (American Type Cell Collection, Manassas, VA, USA), y se determinó la inhibición al crecimiento y la adherencia de las mismas sobre las diferentes superficies. La cepa P. aeruginosa se sembró en un caldo de BHI (Becton, Dickinson Co, StLakes, NJ, USA) y se incubó durante 24 h a 37 °C; posteriormente se sembraron en placas con agar nutritivo (ICMT, Sabaneta, Colombia) durante 24 h a 37 °C, con el fin de obtener colonias aisladas para la preparación del inóculo. De cada placa de cultivo se seleccionó una o dos colonias aisladas con morfología similar, las cuales se resuspendieron en 3 ml de solución salina estéril. De esta manera se obtuvo una turbidez ajustando al patrón 0,5 de la escala de Mc Farland (por comparación visual con el estándar), correspondiente a una concentración de aproximada de 1 a 2 x 10⁸ UFC/ml. Se realizó un recuento de colonias crecidas sobre el material luego de 24 h de incubación.

2.3.1.1. Prueba de inhibición del crecimiento bacteriano.TOP

Para la realización de esta prueba se adicionaron 100 μl del inóculo de bacterias ajustado al 0,5 de Mc Farland en 100 ml de Agar LB a 37 °C, se homogenizó y se sirvieron 20 ml del medio de cultivo conteniendo la cepa bacteriana en cajas de Petri. Las muestras de silicio con y sin recubrimiento y previamente esterilizadas por autoclave, se colocaron en el centro de la caja y se dejaron en una cabina de flujo hasta su gelificación, seguidamente se incubaron durante 24 h a 37 °C. Después de la incubación, se examinó cada caja y se visualizaron las colonias formadas (UFC) que crecieron sobre el material. Las pruebas de inhibición se realizaron por triplicado para asegurar la confiabilidad en los resultados.

2.3.1.2. Prueba de adherencia bacteriana en los recubrimientos.TOP

Una vez esterilizadas las muestras en un autoclave a 120 °C durante 30 min, se depositó una muestra de cada recubrimiento en una caja de Petri estéril, luego se adicionaron 20 μl del inóculo de bacterias preparado conteniendo 1 a 2 × 10⁸ UFC/ml y se dispersaron sobre la superficie de cada material. Los materiales expuestos a la suspensión de bacterias P. aeruginosa se incubaron durante 1 h a 37 °C. Después de la incubación, se examinó cada placa y se visualizaron las UFC de colonias de las bacterias que crecieron sobre los recubrimientos tratados térmicamente. Adicionalmente, cada muestra se depositó en un tubo que contenía 3 ml de solución salina estéril para su lavado por agitación. Posteriormente cada pieza de material se retiró y se fijó para su análisis por microscopia electrónica de barrido. Mediante esta técnica se analizó la superficie de los recubrimientos y la interacción de las bacterias con la misma. Las pruebas de adherencia bacteriana se realizaron por triplicado para asegurar la reproducibilidad.

2.3.2. CitotoxicidadTOP

La citotoxicidad del recubrimiento se evaluó acorde a la guía ISO 10993-5:2009(E) Biological evaluation of medical devices Part 5: test for in vitro cytotoxicity”, mediante el método MTT (bromuro de 3-(5,4 dimetil tizol-2-I) -2-5 difeniltretrazolium), reactivo que permite medir la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial, detectando la producción de formazán debido a la actividad metabólica de células vivas y activas. Para esta prueba, se utilizaron osteoblastos humanos de la línea celular Saos-2 (ATCC®HTB-85) a una densidad de 100.000 células.cm^-2 y se cultivaron en presencia de cada recubrimiento durante 72 h a 37 °C y 5% CO₂. El material se retiró y las células se incubaron en presencia de 200 uL del reactivo a una concentración de 5 mg.mL^-1 y los platos se incubaron nuevamente durante 4 h en las mismas condiciones. Luego se adicionó en cada pozo 200 μL de Solución de parada compuesta por isopropanol al 50% y 10% de SDS (dodecilsulfato sódico) y se incubaron las células nuevamente durante 30 minutos a temperatura ambiente. La viabilidad celular se determinó con base en la cantidad de formazán producido de acuerdo a la intensidad de color (absorbancia) registrada como Densidades Ópticas (D.O) obtenidas a 570 nm en un espectrofotómetro (Varioskan™ Flash Multimode Reader – Thermo Scientific, USA). Se utilizaron células cultivadas en medio de cultivo solo (en ausencia de material) como control de viabilidad. La citotoxicidad se determinó de acuerdo a los porcentajes de viabilidad y mortalidad obtenidos para cada condición experimental. El porcentaje de viabilidad se calculó con la Ec. (1):

% Viabilidad = (D.O células expuestas al material) / (D.O células control) × 100   (1)

donde la D.O de las células control corresponden al 100% de viabilidad. A su vez, el porcentaje de mortalidad se calculó con la Ec. (2):

% Mortalidad = 100 - % viabilidad para el material.   (2)

Los ensayos de citotoxicidad se realizaron por triplicado en dos experimentos aislados. Todas las muestras fueron esterilizadas en un autoclave a 120 °C durante 30 min, previo a realizar la prueba de citotoxicidad.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓNTOP

3.1. Morfología superficial, microdureza y comportamiento tribológico de los recubrimientosTOP

En la Fig. 2 se muestran las imágenes SEM de la sección transversal de los recubrimientos TaN(Ag). En las Fig. 2 (a-b) correspondiente a los recubrimientos de TaN(Ag)-1 y TaN(Ag)-2, se observa la formación de una estructura densa columnar, de grano fino con cúpulas globulares (Liu et al., 2017). En la Fig. 2c para el recubrimiento TaN(Ag)-3, la estructura columnar ya no es tan definida como las dos anteriores, resultando en una estructura más densa y compacta, el mismo fenómeno se presenta para recubrimientos con cantidades de Ag superiores a 120 W en los recubrimientos TaN(Ag)-4, 5 y 6.

El fenómeno de densificación de los recubrimientos con el incremento de material dopante, es debido fundamentalmente a que el metal de transición de baja dureza difunde a través de los límites de grano columnar de la matriz TaN, coalesciendo y conduciendo a la deformación de la estructura y de paso al reacomodamiento del compuesto (Bhatnagar et al. 2017).

Los perfiles de microdureza y propiedades tribológicas se muestran en la Fig. 3. En la Fig. 3a, la mayor microdureza corresponde a la muestra TaN(Ag)-1, sin embargo es el recubrimiento que presenta la mayor tasa de desgaste, Fig. 3b. El recubrimiento TaN(Ag)-3 presenta la menor tasa de desgaste de todos los sistemas fabricados y un coeficiente de fricción muy por debajo de los aceros inoxidables de uso común en aplicaciones biomédicas, al igual que la microdureza. Esta muestra se toma como referencia para la realización de los tratamientos térmicos posteriores a temperaturas entre 175 °C y 275 °C.

3.2. Caracterización del recubrimiento TaN(Ag)-3TOP

3.2.1. Tratamientos térmicosTOP

El recubrimiento TaN(Ag)-3 que presentó el mejor balance entre propiedades mecánicas y tribológicas fue tratado térmicamente a temperaturas de 175 °C, 200 °C, 225 °C, 250 °C y 275 °C, cada una de ellas durante 4 min. Este procedimiento permitió la difusión controlada de las nanopartículas de plata hasta la superficie, y de paso determinar la mejor relación de tamaño, forma y distribución de las nanopartículas de Ag sobre la superficie del recubrimiento, utilizando las imágenes SEM que se muestran en la Fig. 4.

En la Fig. 5 se muestran los diámetros promedio de las nanopartículas vs la frecuencia expresada en número de nanopartículas, para el recubrimiento TaN(Ag)-3 tratado térmicamente a 175 °C, 200 °C y 225 °C, en los cuales se aprecia una gran cantidad de nanopartículas (elevada frecuencia) que difundieron hacia la superficie del compuesto y presentaron diámetros inferiores a los 100 nm. Se pueden observar también aglomerados de Ag con diámetros que oscilan entre 200 y 400 nm, debido a fenómenos de coalescencia, acorde con (Rycenga et al., 2011; Bhatnagar et al., 2017), muy particularmente para la muestra tratada a 225 °C. Acorde a ello se seleccionó el ciclo a 200 °C durante 4 min como el óptimo debido a la mayor frecuencia de nanopartículas con un tamaño menor a 100 nm, y que presentaron una distribución apropiada sobre toda la superficie del recubrimiento. Una vez realizada ésta evaluación se procedió con los ensayos de carácter biológico.

3.2.2. Análisis químico y formación de fasesTOP

En la Tabla 2 se muestran los resultados de EDX realizado al recubrimiento TaN(Ag)-3 tratado térmicamente a diferentes temperaturas. Los porcentajes atómicos de la Ag se incrementaron después del tratamiento térmico, debido al proceso de difusión de las nanopartículas de Ag hacia la superficie de los recubrimientos (Bai et al., 2016), lo que favorece un enriquecimiento de Ag a nivel superficial en la matriz de TaN. El proceso de difusión tiene lugar mediante dos etapas, la primera de ellas es la difusión de átomos de Ag que se encuentran a unos cuantos nanómetros de la superficie, los cuales al encontrarse con otros forman clústeres; éste proceso se da a bajas temperaturas, donde la energía de activación del sistema es baja. Con el incremento de la temperatura y el aumento de la energía de activación en el sistema, se da el inicio de una segunda etapa de difusión por medio de la cual la conversión de los clusters a nanopartículas, hace que éstas últimas emerjan a la superficie entre las fronteras o límites de grano de la matriz de TaN.

Los difractogramas del recubrimiento TaN(Ag)-3 tratado a diferentes temperaturas se muestran en la Fig. 6; allí puede observarse la formación predominante de la fase cúbica del TaN en la dirección [111], y con menor intensidad en las direcciones [200 y 220]. En todos los recubrimientos se pudo observar que la Ag aparece en picos independientes, dado que éste elemento es inmiscible en la matriz de TaN. La dirección [220] de Ag, presenta muy baja intensidad en todos los recubrimientos. Sin embargo, el pico de Ag en la dirección [111] presenta una mayor intensidad indicando una fuerte texturización en dicha dirección, lo cual está probablemente asociado al crecimiento de las nanopartículas de Ag en esa dirección y su enriquecimiento en la superficie con la temperatura del tratamiento térmico, generando una señal más intensa en la difracción. Así mismo, el pico del TaN con crecimiento preferencial [111] disminuye a favor del pico del TaN en la dirección cristalográfica [200] con el aumento de la temperatura.

En la Fig. 7, se aprecian los resultados de microdureza, coeficiente de fricción y tasa de desgaste para el recubrimiento TaN(Ag)-3 tratado térmicamente a diferentes temperaturas. En la Fig. 7a se observa que la dureza alcanza un valor máximo a una temperatura de 200 °C, y luego disminuye continuamente con el aumento de la temperatura de tratamiento. Esto es debido probablemente a la deformación de la estructura del TaN y la inducción de tensiones residuales por el incremento de la plata a nivel superficial. Sin embargo, a temperaturas mayores a 200 °C, la dureza disminuye debido al elevado contenido de plata que, por su baja dureza, contrarresta el efecto endurecedor obtenido inicialmente. En la Fig. 7b se observa que el coeficiente de fricción y la tasa de desgaste disminuyen con el aumento de la temperatura, esto se debe a que a una mayor temperatura el contenido de Ag en la superficie es mayor, y allí se activan los procesos de auto-lubricación que ejercen las partículas de Ag, atribuido a la ductilidad de este metal. Sin embargo, por encima de 200 °C la tasa de desgaste aumenta debido a la baja dureza del compuesto y baja adherencia que poseen estos recubrimientos, y que conducen a que el contracuerpo de alúmina entre en contacto con el sustrato en tiempos menores. Con base en los anteriores resultados la muestra TaN(Ag)-3 tratada a 200 °C presentó la mayor dureza y menor tasa de desgaste y se seleccionó para la siguiente evaluación del comportamiento biológico.

3.2.3. Mojabilidad y rugosidadTOP

En la Tabla 3, se relacionan los valores de los ángulos de contacto del recubrimiento TaN(Ag)-3 con y sin tratamiento térmico, así como de una muestra de silicio sin recubrimiento y un fragmento de vidrio, como superficies control. El silicio y el vidrio poseen superficies de carácter hidrofílico, contrario al recubrimiento TaN(Ag)-3, cuya superficie tiene un comportamiento hidrofóbico cuando se realiza el tratamiento térmico a la muestra. Este comportamiento está relacionado con la cantidad de nanopartículas de plata difundidas hasta la superficie, que conllevan un incremento de la rugosidad (aunque sigue siendo de un valor nanométrico) y una reducción de la energía superficial del compuesto (Baghriche et al., 2012).

En la Fig. 8 se ilustra los resultados de la medición de ángulo de contacto del recubrimiento TaN(Ag)-3, muestra de silicio y fragmento de vidrio. El grado de mojabilidad de las superficies es uno de los factores que influyen de forma directa, no solo en la fijación celular, sino también en el anclaje de bacterias y posterior formación de biofilm (Marques et al., 2016). Superficies hidrofílicas favorecen la adhesión bacteriana en comparación con las hidrofóbicas (Jiang et al., 2016). Por lo tanto la mojabilidad es una propiedad superficial del material que debe ser controlada apropiadamente acorde a la aplicación del mismo.

3.2.4. Efecto bactericida de la muestra TaN(Ag)-3TOP

3.2.4.1. Prueba de inhibición del crecimiento bacteriano.TOP

En la Fig. 9 se observa el comportamiento de la muestra TaN(Ag)-3 tratada térmicamente a 200 °C durante 4 min, frente a la inhibición a la bacteria P. aeruginosa (Fig. 9a) después de un tiempo de incubación de 24 h. Se puede ver que ésta muestra inhibe completamente el crecimiento de la bacteria, mientras que las muestras control de silicio y de vidrio permitieron el crecimiento de una gran cantidad de bacterias. Los resultados de esta evaluación indican que el recubrimiento de TaN(Ag)-3 tratado térmicamente a 200 °C durante 4 min, presenta un importante efecto inhibitorio a la proliferación de la bacteria P. aeruginosa, el cual está muy asociado al efecto bactericida que ejercen las nanopartículas y los iones de plata, que se encuentran sobre la superficie del compuesto y que migran al medio de cultivo (Chernousova y Epple, 2013).

3.2.4.2. Prueba de adherencia bacteriana.TOP

La adherencia de P. aeruginosa en el recubrimiento TaN(Ag)-3 tratado térmicamente a 200 °C, se muestra en la Fig. 10a. Tanto en el recubrimiento como en la muestra de silicio y el fragmento de vidrio se observa una presencia escasa de P. aeruginosa, Fig 10 (b y c), respectivamente. Este comportamiento está posiblemente asociado a la baja rugosidad de éstos materiales (Tabla 2), que entre mayor sea, favorece la adhesión y fijación bacteriana (Truong et al. 2010). Por otro lado, los materiales o recubrimientos cuyas superficies presentan carácter hidrofóbico como el TaN(Ag)-3 tratado térmicamente, poseen también una baja energía superficial, que obstaculizan la adhesión o anclaje de la P. aeruginosa, sugiriendo un modo de acción bacteriostático del material, es decir que detiene el crecimiento del microorganismo produciendo una muerte lenta y evitando la proliferación bacteriana sobre la superficie y con ello, la posterior formación de colonias (Bowker, 2009), tal como se observa en los tres materiales de la Fig. 10.

Además de los mecanismos de interacción como las fuerzas de Van Der Waals y las propiedades hidrofílicas e hidrofóbicas del material, la rugosidad juega un rol fundamental en la adherencia bacteriana. Sin embargo la capacidad de adherencia de las bacterias, depende de la naturaleza del microorganismo, su morfología (forma, tamaño, prolongaciones, filias o pilis), mecanismos de defensa, energía superficial, grado de mojabilidad de su superficie y potencial z. El estudio de Truong et al. (2010), reveló que la superficie de la pared de la cepa P. aeruginosa, presenta un comportamiento moderadamente hidrofílico (43±8°), tendiendo éstas a adherirse con mayor facilidad a superficies hidrofílicas (Truong et al., 2010). Estudios previos realizados in vitro e in vivo, sugieren que cuando la plata entra en contacto con la pared celular de las bacterias tipo Gram-negativa, caso de P. aeruginosa, ésta interrumpe los múltiples procesos que allí se llevan a cabo, conduciendo a la producción de especies oxígeno-reactivas permitiendo la permeación de la membrana del microorganismo (Morones-Ramirez et al., 2013).

3.2.5. CitotoxicidadTOP

Acorde a la evaluación de citotoxicidad mediante el método MTT, utilizando Osteoblastos humanos del tipo Saos-2, el recubrimiento con TaN(Ag)-3 no tuvo efecto citotóxico sobre las células Saos-2, donde un 100% de la población sobrevivió durante el ensayo. Para el acero inoxidable AISI 316L, el porcentaje de viabilidad es un poco menor (Fig. 11). Estos resultados sugieren que el recubrimiento TaN(Ag)-3 es potencialmente no citotóxico.

4. CONCLUSIONESTOP

AGRADECIMIENTOSTOP

Los autores agradecen al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación –COLCIENCIAS, por la financiación de este proyecto (CT-0940-2012) y a la Universidad de Antioquia.

REFRENCIASTOP